Chemienobelpreis 1993: Kary Banks Mullis — Michael Smith
Die beiden Wissenschaftler erhielten den Nobelpreis für »ihre Beiträge zur Entwicklung von Methoden innerhalb der Chemie der DNS«.
Biografien
Kary Banks Mullis, * Lenoir (North Carolina, USA) 28. 12. 1944; 1972 Promotion in Biochemie an der University of California (Berkeley), 1979-86 Forschungsarbeit bei der Cetus Corporation in Emeryville (Kalifornien), 1987-92 Berater von biotechnologischen und pharmazeutischen Unternehmen.
Michael Smith, * Blackpool (England) 26. 4. 1932, ✝ Vancouver (Kanada) 4. 10. 2000; 1961-66 Fisheries Research Board of Canada Laboratory (Vancouver); 1966 Berufung an das Department of Biochemistry der University of British Columbia in Vancouver, 1981 wissenschaftlicher Mitbegründer der biotechnologischen Firma Zymos.
Würdigung der preisgekrönten Leistung
Die Idee zur Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) kam Kary Banks Mullis im April 1983 in einer kalifornischen Frühlingsnacht, als er von Berkeley nach Mendocino County fuhr, wo er eine kleine Hütte in den Wäldern hatte.Mullis arbeitete in diesen Jahren für die Cetus Corporation und hatte viel mit der chemischen Synthese von Oligonucleotiden zu tun, die bei der von ihm entwickelten PCR eine wesentliche Rolle spielen.
Die Polymerase-Kettenreaktion
Ziel bei der PCR ist, Fragmente der Desoxyribonucleinsäure (DNS, auch DNA; das A steht für das englische »Acid« für »Säure«), also Teilstücke des genetischen Materials, in vitro zu vermehren. Die PCR verläuft in drei Stufen. Zuerst wird die DNS, die die zu vermehrende Nucleotidsequenz enthält, durch Erhitzen auf 94 Grad Celsius in zwei DNS-Einzelstränge aufgetrennt. In der zweiten Stufe reagieren so genannte Primer mit diesen langen Einzelsträngen. Bei den Primer-Molekülen handelt es sich um Oligodesoxynucleotide, die aus 20-30 Nucleotidbausteinen bestehen. Die Nucleotidsequenz dieser Primer ist so gewählt, dass sie durch komplementäre Basenpaarung an den seitlichen Bereichen der zu vermehrenden DNS-Stücke andocken, sie werden anhybridisiert. Die so entstehenden doppelsträngigen DNS-Bereiche sind im dritten Schritt das Substrat für ein DNS-Polymerase-Enzym. Ein solches Enzym bewirkt, dass die Bereiche der Primer in einer Richtung verlängert werden. Es werden ebenfalls in komplementärer Weise in der Reaktionslösung vorhandene Nucleotidbausteine angebaut. Die Reaktionslösung muss die vier Nucleotid-Grundbausteine enthalten, aus denen sich DNS aufbauen lässt. Auf diese Weise werden DNS-Doppelstränge gewonnen, die durch die Primermoleküle begrenzt werden. Diese Doppelstränge werden wiederum durch Erhitzen getrennt und dienen als Matrize für vorhandene Primer. Dieser Prozess wird vielfach wiederholt und die Menge der vervielfältigten DNS-Fragmente wächst exponentiell an. In Analogie zur Kettenreaktion bei der Atomkernspaltung wählte man zur Charakterisierung dieses Reaktionsablaufs den Namen »chain reaction«, Kettenreaktion. Nach 30 PCR-Zyklen kann man so von einem DNS-Fragment etwa eine Milliarde Kopien herstellen. Durch den Einsatz thermostabiler DNS-Polymerasen war eine Automatisierung des Verfahrens möglich. Die PCR-Methode entwickelte sich in wenigen Jahren zu einer analytischen und präparativen Standardmethode in der Molekularbiologie. In der Medizin dient sie vor allem dazu, virale Infektionen und Genmutationen bei Erbkrankheiten genau zu diagnostizieren. Auch in der Kriminalistik hat sie einen festen Platz eingenommen. Da es durch diese Methode möglich ist, DNS-Fragmente aus geringsten Mengen hinterlassener biologischer Spuren (Blut oder Sperma) des Täters zu vervielfältigen, erhält man genügend DNS-Material, um dieses mit DNS-Material von potenziellen Tätern zu vergleichen. Die Cetus Corporation verkaufte das US-Patent Nr. 4868202 für 300 Millionen Dollar an das Unternehmen Hoffmann-La Roche AG. Mullis erhielt nur eine Prämie von 10 000 Dollar.
Der Trick mit den fehlerhaften Primern
Oligonucleotide spielen auch bei der von Michael Smith entwickelten molekularbiologischen Methode der Site-Directed Mutagenesis (Ortsspezifische Mutagenese) eine entscheidende Rolle. Dabei geht es darum, Mutanten von Proteinen zu gewinnen, die sich in einer einzigen Aminosäure unterscheiden. Da in Organismen die Aminosäuresequenzen von Proteinen prinzipiell durch Nucleotidsequenzen der DNS bestimmt werden, muss man an diesen Nucleinsäuresequenzen Veränderungen vornehmen, um zu geänderten Aminosäuresequenzen zu kommen. Die große Leistung von M. Smith besteht darin, eine Methode entwickelt zu haben, die es gestattet, auf den Punkt genau Nucleotidsequenzen zu ändern. Da eine Aminosäure jeweils durch ein Codon (Sequenz von drei Nucleotidbasen) codiert wird, muss man dieses abändern. So wird die Aminosäure Serin unter anderem durch die Basensequenz TCT codiert (T steht für Thymin, C für Cytosin). Will man anstelle des Serins im Protein die Aminosäure Cystein setzen, so muss man in der Nucleotidsequenz TCT Cytosin durch Guanin ersetzen, denn TGT codiert Cystein. Ausgearbeitet wurde die ortsspezifische Mutagenese anfangs an einzelsträngiger, ringförmiger DNS von Bakteriophagen. Die weitere Entwicklung dieser Methode führte auch zum Einsatz von Plasmiden, bei denen es sich um kleine doppelsträngige DNS-Ringe handelt, die in Bakterien vorkommen. In solche isolierten Plasmide baut man das Gen ein, das man an einer ganz bestimmten Stelle in seiner Basenzusammensetzung verändern will. Für die Durchführung der Mutagenese ist es notwendig, die Basensequenz in der Nachbarschaft der zu verändernden Stelle zu kennen. Nach dem Auftrennen des Plasmiddoppelstrangs in Einzelstränge hybridisiert man an diese Region des einen Einzelstrangs einen komplementären Oligonucleotidprimer an. Dieser Primer ist aber bewusst »fehlerhaft« konstruiert. In Bezug auf das oben gewählte Beispiel für eine Genmutation enthält er an der zu verändernden Stelle nicht die Basensequenz TCT, sondern TGT. Nach dem Anhybridisieren des Primers wird dieser wie bei der Polymerase Chain Reaction verlängert, sodass wieder ein vollständiger Doppelstrang entsteht. Dieser den Primer enthaltende DNS-Doppelstrang wird mithilfe eines Enzyms, der DNS-Ligase, zu einem Plasmidring geschlossen, der dann in Bakterien eingeschleust wird. Werden diese Bakterien vermehrt, entstehen zwei Sorten von Plasmidnachkommen: In der einen Sorte ist die TCT-Basensequenz vertreten, in der anderen die TGT-Basensequenz. Exprimiert man die Plasmide mit dem TGT, so erhält man das modifizierte Protein, das anstelle von Serin Cystein enthält.
Mit der Methode der ortsspezifischen Mutagenese kann man beispielweise Enzyme, die in biotechnologischen Verfahren als Katalysatoren eingesetzt werden, in ihren Eigenschaften verbessern. Die Methode nach Smith hat generell in der Aufklärung von Zusammenhängen zwischen Struktur und Funktion von Proteinen in der biochemischen Forschung eine herausragende Bedeutung erlangt. In der medizinischen Forschung versucht man mithilfe dieser Methode zum Beispiel auch spezifische Antikörper zu gewinnen, die bei der Bekämpfung von Krebs eingesetzt werden können. Die ortsspezifische Mutagenese eröffnet prinzipiell auch Möglichkeiten, genetisch bedingte Krankheiten zu analysieren und deren molekulare Ursachen zu beseitigen.
A. Neubauer